產(chǎn)品信息
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 單價/元 |
TSM99K2 | EZ-Tn5™ | 10 rxns | 6775 |
TY0261H | TypeOne™ Restriction Inhibitor/TypeOne™限制抑制劑 | 100 µg | 2469 |
TSM08KR | EZ-Tn5™ | 10 rxns | 7232 |
產(chǎn)品簡介
是EZ-Tn5轉(zhuǎn)座酶和EZ-Tn5
R6Kγori使該轉(zhuǎn)座子可用于“營救”隨機插入轉(zhuǎn)座子的基因組DNA區(qū)域。 第2頁概述了營救克隆過程。首先將轉(zhuǎn)染EZ-Tn5
試劑盒中提供了未標記的正向和反向轉(zhuǎn)座子特異性引物。 這些引物可用于雙向DNA測序或靶基因組DNA或救援克隆中轉(zhuǎn)座子插入位點的作圖。
組成成分：
? EZ-Tn5
? KAN-2 FP-1 Forward Primer (50 µM)：儲存在-20°C
? R6KAN-2 RP-1 Reverse Primer (50 µM)：儲存在-20°C
? Nuclease-Free Water, Sterile：儲存在-20°C
數(shù)據(jù)：
可以將EZ-Tn5轉(zhuǎn)座體復(fù)合物電轉(zhuǎn)到活細胞中，在其中隨機插入轉(zhuǎn)座子插入位點，可以是宿主的基因組DNA。 EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點可以通過多種方法進行分析。
相關(guān)產(chǎn)品：
? TypeOne Restriction Inhibitor（# TY0261H）
? TransforMax EC100D pri+ Electrocompetent E.coli（# ECP09500 ）
? TransforMax EC100D pir-116 Electrocompetent E.coli（# EC6P095H）
參考文獻：
1. Hoffman, L.M. and Jendrisak, J. (1999) Epicentre Forum, 6 (3), 1.
2. Goryshin, I.Y. et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18, 97.
3. Metcalf, W.W. et al., (1994) Gene, 138, 1.
注：使用EZ-T連接試劑盒應(yīng)嚴格遵循無菌操作規(guī)程，以防細菌污染造成試劑盒組分失效。
2．混合，短暫離心。
3．25℃反應(yīng)5分鐘。
4．取2 μl連接反應(yīng)液加入至50 μl感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。
5．42℃加熱45~60秒鐘，冰中放置2分鐘。
6．加入800 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37 ℃250 rpm振蕩培養(yǎng)40~60分鐘，使β-內(nèi)酰胺酶基因表達。
7．在含有X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜。
8．挑選白色菌落，使用質(zhì)?？焖偬崛》ǎ‥Z-Lyse克隆快速檢測試劑盒，Cat No. T171）或菌落PCR法（EZ-PCR重組菌落PCR檢
測試劑盒，Cat No. T172）鑒定是否有插入片段。
FAQ
Q1：TA克隆對PCR產(chǎn)物有何要求？
A1：首先，PCR應(yīng)使用無校讀活性的DNA聚合酶(如Taq或Tth)以確保PCR產(chǎn)物的3’末端有突出的A堿基。使用高保真DNA聚合酶(如Pfu、Pfx、Pwo、Vent、Phusion、KOD等)擴增的平末端PCR產(chǎn)物不能直接進行TA克隆，但可使用Taq DNA聚合酶添加3’-端A堿基后，再與T載體連接。其次，TA克隆zuihao使用經(jīng)過純化的PCR片段。特異性好的PCR產(chǎn)物可不經(jīng)過切膠回收純化，但應(yīng)采用柱純化或乙醇沉淀的方法去除殘留引物、dNTP、引物二聚體等，再與T載體連接，否則影響克隆效率。
Q2：PCR引物設(shè)計對TA克隆效率有無影響？
A2：引物的5’-末端設(shè)計為G或A更有利于提高TA克隆效果。
Q3：為何有時切膠回收的PCR產(chǎn)物TA克隆效率仍然很低？
A3：經(jīng)切膠回收純化的PCR產(chǎn)物具有更高的TA克隆陽性率。然而如果PCR產(chǎn)物在紫外線下暴露的時間過長，會引起DNA變性而降低連接效率。因此切膠時動作要快，盡量減少紫外線下暴露的時間。
Q4：為何有時切膠回收的PCR產(chǎn)物TA克隆后檢測發(fā)現(xiàn)插入的片段大小不一？
A4：切膠回收應(yīng)采用新鮮配置的瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液，否則回收的DNA片段極有可能被凝膠或電泳緩沖液中殘留的DNA污染。
Q5：為何有時得到的藍色菌落也含有插入片段？
A5：1 kb以下的插入片段在沒有破壞lacZ基因的讀碼框的情況下會產(chǎn)生藍色或淡藍色的菌落。因此如果觀察到整板都是藍色或淡藍色菌落時，不妨挑選一些進行篩選。
Q6：EZ-T載體可以克隆的PCR片段大小的上下限是多少？
A6：EZ-T載體推薦用于克隆50 bp~3 kb的PCR片段。經(jīng)驗表明，3 kb以上片段的連接和轉(zhuǎn)化效率比較低，此時可通過加大EZ-T載體用量、適當延長連接時間和使用轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細胞來提高克隆陽性率。
