ELISA吸附技術是一種已確立的植物病毒檢測方法,尤其適用于大量材料的檢測。然而,該檢測技術中所便用的一次性的聚苯乙烯微量反應板的花費卻是很大的。不少研究者曾嘗試用各種方法去清洗反應板,以便能再使用。
進行雜合反應時所使用的探針若為放射性物質所標定者，雜合訊息可經(jīng)由放射顯影術偵測出來；若為DIG所標定者，則需借助anti-DIG抗體與堿性去磷酸酶的conjugate，并利用堿性去磷酸酶的酵素活性轉現(xiàn)雜合反應訊息。目前常用來進行堿性去磷酸酶呈色反應的基質為NBT(nitroblue tetrazolium) 與BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt)； 此外，也可以選用CSPD或CDP-Star等試劑，以增加檢測敏感度。
其詳細操作步驟及注意事項如下：
◆注意：
a.以下反應條件與程序主要是參照DIG nucleic acid detection kit 制造廠商所提供的產品說明書。
b.北方與南方雜合的尼龍膜可同步處理，所有反應于室溫進行。
c.以平端鑷子將尼龍膜自一種溶液移至次一種溶液時，盡可能滴干前者的殘留部份，以免影響后續(xù)反應。
d.浸洗過程應以搖蕩器低速搖動 (50 rpm)，以便加強作用。
1)進行anti-DIG/AP conjugate 與DIG-核酸探針的免疫結合反應：
a)以50 mL 的washing buffer 浸洗尼龍膜1 min。
b)Blocking：把尼龍膜放入20 mL blocking solution 作用30 min，以便填充尼龍膜上的非專一性結合部位。
c)取出2 μL 的anti-DIG-AP conjugate，并以10 mL 的blocking solution 稀釋。
d)免疫結合反應：把anti-DIG-AP conjugate 稀釋液連同尼龍膜一起放入塑料袋內，仔細除去氣泡并封口的后，低速搖動作用30 min。
e)以50 mL washing buffer 浸洗尼龍膜2 次 (每次15 min)，以便去除多余及非專一性結合于尼龍膜的anti-DIG-AP conjugate。
f)將尼龍膜放置于20 mL 的detection buffer 漂洗2 min。
2)堿性去磷酸酶呈色反應：
a)取出尼龍膜，放入10 mL 現(xiàn)配的color-substrate solution，并隨即把尼龍膜及作用溶液移至黑暗環(huán)境 (例如抽屜內) 作用。每幾分鐘檢視一次，待紫色條帶出現(xiàn)時即可終止反應。
b)欲終止反應時，請把尼龍膜移至50 mL TE 浸漬5 min。
c)拿出尼龍膜，滴干反應液后放置于衛(wèi)生紙上風干至少30 min，加以護貝即可保存。
