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上海一研生物科技有限公司

酵母感受態(tài)細(xì)胞制備方法

時間:2015-9-14閱讀:850
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    酵母感受態(tài)細(xì)胞制備可以:(1)用于建立酵母轉(zhuǎn)化體系;(2)用于酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建;(3)用于酵母其他分子生物學(xué)研究。

一、試劑與耗材

1. 試劑

細(xì)菌用-酵母提取物(Fisher)、 細(xì)菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、細(xì)菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油(Sigma)、二甲基亞砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸鋰(Sigma)、鮭魚精子細(xì)胞DNA(Invitrogen)、酵母無氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-嗎啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。

2. 儀器

水浴鍋(VWR)、離心機(Eppendorf)、30 °C搖床與恒溫培養(yǎng)箱(VWR)、培養(yǎng)皿。

二、 試劑配方

1. YPDA液體或固體培養(yǎng)基

(1)1%酵母提取物: 10 g/L

(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L

(3)2%葡萄糖:20 g/L

2. 轉(zhuǎn)化液

(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl

(2)1 M醋酸鋰:36 μl

(3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl

(4)質(zhì)粒:3 μl

(5)總計:360 μl

3. YNB+ MA 培養(yǎng)基(100 ml)

(1)YNB:0.67 g

(2)2-(N-嗎啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g

(3)腺嘌呤:0.01 g

(4)瓊脂粉:2g

(5)葡萄糖:2g

三、制備步驟

1. 在轉(zhuǎn)化實驗的兩天前,于YPDA培養(yǎng)基的平皿上活化酵母菌株。

2. 轉(zhuǎn)化前一天,挑取活化的酵母細(xì)胞(單克?。┯赮PDA液體培養(yǎng)基中,30°C,200 rpm培養(yǎng)過夜。

3. 將培養(yǎng)過夜的酵母細(xì)胞液按1:3的比例轉(zhuǎn)接與新的YPDA液體培養(yǎng)基中,于30°C搖床內(nèi),200 rpm培養(yǎng)4 h。

4. 3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細(xì)胞,用0.5倍體積的無菌水洗酵母細(xì)胞。

5. 再次3 000 g 離心 5分鐘。

6. 用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細(xì)胞,并轉(zhuǎn)入適宜的離心管中,20°C ,3 000 g 離心 5分鐘。

7. 用0.01倍體積的無菌細(xì)胞懸浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亞砜)重懸酵母細(xì)胞。

8. 將重懸的酵母細(xì)胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。

9. 將管放入塑料盒或者紙盒中(逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率)。

10. 將裝有酵母細(xì)胞的盒子放入-80°C冰箱。(細(xì)胞在-80°C能夠保存一年以上)。

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