質(zhì)粒DNA的大量制備
在豐富培養(yǎng)基中擴增質(zhì)粒 
細菌的收獲和裂解 
收獲 
堿裂解法

（一）在豐富培養(yǎng)基中擴增質(zhì)粒 許多年來，一直認為在*存在下擴增質(zhì)粒只對生長在基本培養(yǎng)基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2－5mg質(zhì)粒DNA，而且重復性也很好。ELISA試劑盒 
1）將30ml含有目的質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期（DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關(guān)物進行接種。 
2）將含相應抗生素的 500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預加溫至37℃）施放入25ml對數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時（搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。 
3）可做可不做：加2.5ml*溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像 pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復的質(zhì)粒，有必要通過擴增。這些質(zhì)粒只要從生長達到餉新一代的質(zhì)粒（如pUC質(zhì)粒）可復制達到很高的拷貝數(shù)，因此無需擴增。這些質(zhì)粒只要從生長達到飽和的細菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用*進行處理，具有抑制細菌復制的優(yōu)點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質(zhì)粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養(yǎng)物里加入*略顯不便，但用*處理還是利大于弊。 4）于37℃劇烈振搖（300轉(zhuǎn)/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時。

（二）細菌的收獲和裂解
1．收獲 
1）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。 
2）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。 
STE 
0.1mol/L NaCl 
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
2）按步驟1）所述方法離心，以收集細菌細胞。ELISA試劑盒

2，堿裂解法 
1）將冼過的500ml 培養(yǎng)物的細菌沉淀物[ 來自收獲細菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。 
溶液Ｉ 
50mmol/L 葡萄糖 
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
10mmol/L EDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，在 10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。 
2）加1ml(2ml)新配制的*溶液 [10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值低于8.0時，*不能有效工作。 
3）加 20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） 
1％SDS 
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。
4）加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。 
溶液Ⅲ 
5mol/L乙酸鉀 
60ml 冰乙酸 
11.5ml 水 
28.5ml 所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。 
封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時應不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放 10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質(zhì)－膜復合物。
5）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分[步驟4）]。 
6）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。 
7）用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。 
8）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮殆盡。 
9）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。ELISA試劑盒