膠原酶

1．用滅菌的*或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用Hanks*（HBSS）將組織碎塊清洗數(shù)次。

2．加入膠原酶（50-200單位/ml膠原酶HBSS）。

3．在37℃ 下孵育4-18小時(shí)。加入3mM CaCl2 可以提高解離效率。

4．用滅菌的不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸浮液，將離散的細(xì)胞和組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進(jìn)一步解離，可向組織片段中加入新鮮的膠原酶。

5．通過(guò)離心HBSS清洗細(xì)胞懸浮液數(shù)次。

6．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

分散酶

1．用滅菌的*或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用不含鈣鎂離子的*清洗組織碎塊數(shù)次。

2．加入分散酶（0.6-2.4單位/ml分散酶不含鈣鎂的*）。

3．在37℃下孵育20分鐘至數(shù)小時(shí)。

4．用滅菌的不銹鋼網(wǎng)或尼友網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸浮液，將離散的細(xì)胞和組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進(jìn)一步解離，可向組織片段中加入新鮮分散酶。

5．通過(guò)離心*清洗細(xì)胞懸浮液數(shù)次。

6．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

*

1．先去除無(wú)關(guān)組織，然后用滅菌的*或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。通過(guò)在不含鈣鎂的*進(jìn)行重懸來(lái)清洗組織碎塊。待組織碎塊沉降后去掉上清液。重復(fù)清洗2-3次。

2．將裝有組織碎塊的容器置于冰上，去掉所有上清液。在不含鈣鎂的*中加入0.25%*（每100mg組織大約需要1ml *）。

3．在4℃ 下孵育6-18小時(shí)，使低活性的*盡量滲入組織。

4．緩慢倒掉*。在37℃ 下將殘余的*與組織碎塊共同孵育20-30分鐘。

5．向組織碎塊加入溫?zé)岬?培養(yǎng)基，并輕輕地吹吸以分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基。還應(yīng)加入大豆*抑制劑。

6． 用滅菌的不銹鋼網(wǎng)（100-200μm）過(guò)濾細(xì)胞懸浮液，直至所有組織*散開。計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。