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上海一研生物科技有限公司
中級會(huì)員 | 第11年

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ELISA試劑盒批發(fā)酶與抗體交聯(lián)的方法

時(shí)間:2018/9/13閱讀:1417
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     ELISA試劑盒批發(fā)供氫體的種類很多,形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物,并有電子密度,故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不夠大,且空白孔不易控制到無色,現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高,但反應(yīng)中受溫度影響較大,而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定,需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是:OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色,后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色,二者的可溶性均好,在避光處顏色穩(wěn)定,空白可近于無色,靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外,還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色,且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面,ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

     

       在不斷攪拌下,每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度,0℃),大約在1~2h內(nèi)加完,置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出,下面混濁液以3 000r/min離心15min,棄沉淀,合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌,當(dāng)硫酸銨全部溶解后,置冷室過夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000r/min離心20min,棄去上清液,收集沉淀。

     由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑,因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

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