在臨床實(shí)驗室，對試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，ELISA試劑盒其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在的是在實(shí)驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，

①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。

② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。

③底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL，混勻。

7. 終止液：2mol/LH2SO4

四、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板

中。4℃放置過夜。

②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h。

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍(lán)色。

⑩終止反應(yīng)、比色：加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標(biāo)儀測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測樣品的效價。

       目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時配制。