在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測(cè)兩種抗原時(shí),需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?。雙重免疫熒光標(biāo)記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。
(1)直接法雙重免疫熒光標(biāo)記:將標(biāo)記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合,滴加在標(biāo)本上孵育,然后洗去未結(jié)合的熒光抗體,在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察,即可對(duì)兩種抗原進(jìn)行定位和定量。直接法簡(jiǎn)便可靠,但靈敏度較低。
(2)間接法雙重免疫熒光標(biāo)記:用未標(biāo)記的兩種特異性*抗體孵育組織或細(xì)胞,洗去多余的*抗體后,再用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記的第二抗體孵育組織或細(xì)胞,洗去多余的第二抗體,后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應(yīng)的激發(fā)濾片觀察,從而對(duì)兩種抗原進(jìn)行定位和定量。使用此法應(yīng)注意兩種特異性*抗體必須來(lái)源于不同種屬,且熒光標(biāo)記第二抗體的種屬必須與*抗體的種屬相匹配。
免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)
一、免疫熒光技術(shù)中標(biāo)本制作的基本程序近似于酶免疫組化,不同點(diǎn)如下:
1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理,封閉和一抗孵育與其相同。
2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育,孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。
4、免疫熒光在封片時(shí)常使用封片劑或甘油:0.01M PBS (1:1)。條件許可,建議購(gòu)買(mǎi)抗淬滅的封片液,使標(biāo)本可以保存更久。
5、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。
6、熒光抗體染色假陽(yáng)性可能會(huì)多,需要分別設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
二、注意事項(xiàng)
1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)使熒光提前衰退。
2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對(duì)照:
(1) 陽(yáng)性對(duì)照:陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物;
(2) 陰性對(duì)照:陰性血清+熒光標(biāo)記物;
(3) 熒光標(biāo)記物對(duì)照:PBS+熒光標(biāo)記物。
三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談
1、選取一抗時(shí),要求來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物,我們一般用的是來(lái)源于家兔和大鼠的抗體,二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的,我們用的是donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。
2、我們的做法是兩種一抗同時(shí)孵育,然后兩種二抗同時(shí)孵育??贵w濃度、孵育時(shí)間要自我摸索,感覺(jué)一抗4℃孵育過(guò)夜比較好,背景比較清晰。
3、我們的陽(yáng)性對(duì)照采用的是陽(yáng)性組織切片,陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG,熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。
4、封閉血清是二抗來(lái)源動(dòng)物的正常血清,我用的是10%正常donkey血清。
5、其余事項(xiàng)同免疫熒光單標(biāo)操作。
免疫組化雙重染色方法和步驟
在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究實(shí)踐中,經(jīng)常需要檢測(cè)兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品中共存或同一種細(xì)胞中共存,因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重染色。此方法有幾種類(lèi)型,包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合;同一切片的再度染色法(先對(duì)*種抗原染色,陽(yáng)性部位拍照,再用酸處理使抗原抗體解離,繼之,對(duì)第二種抗原染色、拍照);兩種酶標(biāo)抗體3又重染色(分別用辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶標(biāo)記第二抗體.用間接法分別顯示A和B抗原,如兩種一抗來(lái)自同一種屬,常有重疊染色);不同種屬來(lái)源的抗體雙重染色。目前,zui常用的是zui后一種方法。
不同種屬來(lái)源的抗體雙重染色,兩種抗體間無(wú)交又反應(yīng).特異性較高,即使細(xì)胞內(nèi)抗原量很少也能檢測(cè)。但是,當(dāng)兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高,占優(yōu)勢(shì)時(shí)將妨礙另一種抗原染色,此種情況應(yīng)分別染色,首先染色含量較少的抗原,再顯示含量豐富的抗原。在該方法中應(yīng)用zui多的是把SABC法或SP法的實(shí)驗(yàn)流程重復(fù)兩次,其中兩種不同特異性抗體(可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個(gè)組合),與一抗對(duì)應(yīng)的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來(lái)。該方法用于石蠟切片時(shí)應(yīng)考慮所選擇的兩個(gè)抗體的修復(fù)方法應(yīng)該一致或一個(gè)抗體的修復(fù)對(duì)另一個(gè)抗體的染色結(jié)果沒(méi)有影響。
SP法雙重染色步驟
1~6步驟與SABC法相同,但無(wú)需使用生物素阻斷劑:
7.切片加入A特異性抗體(如兔抗A抗體),4=C過(guò)夜孵育后,PBS沖洗3次,每次5分鐘
8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗),室溫孵育切片10分鐘,繼而PBS沖洗3次,每次5分鐘;
9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶,室溫孵育10分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘
10.堿性磷酸酶顯色液(BCIP/NBT)顯色(紫藍(lán)色).PBS沖洗3次,每次5分鐘;
11.滴加0.05%鹽酸,室溫10分鐘(可避免已顯色的抗原褪色);
12.滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清,37~C孵育10分鐘;
13.滴加B特異性抗體(如小鼠抗B抗體),4~C過(guò)夜孵育。PBS沖洗3次,每次5分鐘;
14.滴加生物素化抗小鼠二抗,室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次,每次5分鐘:
15.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶,室溫孵育10分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘
16.過(guò)氧化物酶顯色液(AEC)顯色(鮮紅色).PBS沖洗3次,每次5分鐘
17.蘇木精復(fù)染細(xì)胞核;
18.水溶性封片劑封片。
在使用SP法雙重染色之前需要對(duì)待測(cè)抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類(lèi)型和顯色系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)設(shè)計(jì)。購(gòu)買(mǎi)免疫組化雙染試劑盒時(shí);應(yīng)選擇與設(shè)計(jì)方案相同的配套試劑。在選擇一抗時(shí)應(yīng)避免定位在細(xì)胞的同一部位(如胞核、胞漿和胞膜)的兩種抗原,如果不可避免,選擇免疫熒光組織細(xì)胞化學(xué)雙重染色方法,因?yàn)閮煞N不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光(如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光),它比SP法的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認(rèn)陽(yáng)性結(jié)果。
在進(jìn)行雙重染色之前,必須對(duì)所選擇的一抗分別進(jìn)行單獨(dú)染色預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)條件必須與雙染條件相同,在觀察預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和抗體定位正確后,再進(jìn)行雙染實(shí)驗(yàn)。
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