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敘述PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

2022-10-31  閱讀(194)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù),其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA 段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng),基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似,但反應(yīng)體系相對較簡單。PCR循環(huán)參數(shù):

1.預(yù)變性

模板DNA wan全變性與PCR酶的wan全激活對PCR能否成功至關(guān)重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

2.變性步驟

循環(huán)中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列wan全變性,可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹di,易造成擴(kuò)增失敗。

3.引物退火

退火溫度需要從多方面去決定,一般根據(jù)引物的Tm值為參考,根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶最適溫度)。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴(kuò)增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。

5.循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-35循環(huán),過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.最后延伸

在最后一個循環(huán)后,反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘.使引物延伸wan全,并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。






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