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?PCR反應(yīng)體系解析
2023-5-4 閱讀(226)
PCR反應(yīng)體系解析如下：
1、引物
引物與模板配對的長度應(yīng)至少為17個核苷酸，最高不宜超過30個核苷酸，最佳長度為20-24個核苷酸，如需插入酶切位點，應(yīng)在酶切位點5'端多加幾個堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體；兩個引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似；引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)；兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補；特別是在引物3'端最好有富有GC，這樣退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右，濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增，太低則擴增產(chǎn)物太少。
2、模板
模板可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板量一般不需太多，不超過1μg為宜，因為模板量過多可能導(dǎo)致非特異性擴增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如：使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。
3、緩沖液buffer
緩沖液的PH值，鹽離子濃度、助溶劑成分等都會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM，可以適用于大多數(shù)PCR反應(yīng)，但它并非對任何模板和引物的組合都是最佳的。
4、DNA聚合酶
50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶，酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機率，尤其在進行高保真擴增時，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過少時反應(yīng)性能會下降。
