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?PCR反應(yīng)體系解析

2023-5-4  閱讀(226)

PCR反應(yīng)體系解析如下:

1、引物

引物與模板配對的長度應(yīng)至少為17個核苷酸,最高不宜超過30個核苷酸,最佳長度為20-24個核苷酸,如需插入酶切位點,應(yīng)在酶切位點5'端多加幾個堿基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量組成應(yīng)均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體;兩個引物中(G+C)%含量應(yīng)盡量相似;引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的二級結(jié)構(gòu),如發(fā)夾結(jié)構(gòu);兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補;特別是在引物3'端最好有富有GC,這樣退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或PAGE純化,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右,濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增,太低則擴增產(chǎn)物太少。

2、模板

模板可以是單鏈DNA,也可以是雙鏈DNA,質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板量一般不需太多,不超過1μg為宜,因為模板量過多可能導(dǎo)致非特異性擴增增加,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如:使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,就需要適當(dāng)加大模板用量。

3、緩沖液buffer

緩沖液的PH值,鹽離子濃度、助溶劑成分等都會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM,可以適用于大多數(shù)PCR反應(yīng),但它并非對任何模板和引物的組合都是最佳的。

4、DNA聚合酶

50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶,酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關(guān),酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng),而且可能增加突變的機率,尤其在進行高保真擴增時,應(yīng)盡量減少酶量,但酶量過少時反應(yīng)性能會下降。




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