解析細(xì)胞MTT的用途及原理

MTT主要有兩個(gè)用途：

.藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定;

2.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。

檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。

貼壁細(xì)胞：

、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入00ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至000-0000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔00ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3、5%CO2，37℃孵育6-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6、每孔加入50ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩0min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細(xì)胞：

、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度×06/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的640（無血清）培養(yǎng)基40ul ;②加Actinomycin D（有毒性）0ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲(chǔ)存液00mg/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，:0-:20）;③需檢測物0ul;④細(xì)胞懸液50ul（即5×04cell/孔），共 00ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加00ml 640）。

2、置37℃，5%CO2孵育6-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入0 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞使用WST-，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）

4、離心（000轉(zhuǎn)x0min），小心吸掉上清，每孔加入00 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩0 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。

5、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。