．原理有絲分裂原可以使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。淋巴母細(xì)胞表達(dá)豐富的IL一2受體，該細(xì)胞在體外IL一2存在時(shí)能連續(xù)培養(yǎng)，并與IL一2含量呈劑量依賴關(guān)系。它對(duì)有絲分裂原無反應(yīng)性或反應(yīng)極微。因此，在無IL-2依賴細(xì)胞株的情況下，可以用此細(xì)胞作IL一2檢測(cè)。

2．材料

()IL-2待測(cè)樣品，用0％FCS RPMI 640培養(yǎng)液倍比稀釋。

(2)IL一2、刀豆蛋白A(ConA)標(biāo)準(zhǔn)品。

(3)C57BL／6小鼠。

(4)3 H—TdR(0．5 μci／50μl)。

(5)閃爍液。

(6)9999型玻璃纖維濾紙。

(7)細(xì)胞收集儀。

(8)8液閃計(jì)數(shù)儀。

3．方法

()取C57BL／6小鼠脾臟磨碎后，配成5×06／ml單個(gè)細(xì)胞懸液。

(2)加入ConA 5 μg／ml，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)40～48h。

(3)將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液置于淋巴細(xì)胞分層液上，700 r／mln離心5 min。取界面層細(xì)胞即為IL一2反應(yīng)細(xì)胞(淋巴母細(xì)胞)。

(4)將反應(yīng)細(xì)胞配成×06／ml的懸液，取00μl加入96孔微量培養(yǎng)板。

(5)加入00μl待測(cè)樣品或IL一2標(biāo)準(zhǔn)品，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)40～48h。

(6)每孔加入O．5μci。H—TdR，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)4～6 h。

(7)收集細(xì)胞測(cè)定3 H—TdR摻人量。

4．結(jié)果分析以不同稀釋度的IL一2標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從IL一2標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)得樣品中IL一2的活性單位。

5．注意事項(xiàng)

()此法不必培養(yǎng)CTLL-2細(xì)胞。但由于動(dòng)物的個(gè)體差異，往往使試驗(yàn)結(jié)果批次間差異較大。

(2)淋巴母細(xì)胞的誘導(dǎo)和分離技術(shù)不易掌握，有時(shí)容易混入較多的休止期小淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞仍保留對(duì)ConA的反應(yīng)性。因此，作為檢測(cè)細(xì)胞所含休止期小細(xì)胞不宜超過5%并應(yīng)設(shè)ConA反應(yīng)對(duì)照組。

(3)細(xì)胞培養(yǎng)收獲的時(shí)間一般應(yīng)以無IL一2的對(duì)照細(xì)胞絕大多數(shù)死亡，而加IL一2的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)為佳。