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單克隆抗體制備過程

時間:2016/3/28閱讀:1205
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、免疫動物

免疫動物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠,按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官,刺激相應B淋巴細胞克隆,使其活化、增殖,并分化成為致敏B淋巴細胞。

2、細胞融合

采用二氧化碳氣體處死小鼠,無菌操作取出脾臟,在平皿內(nèi)擠壓研磨,制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合,并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合,形成雜交瘤細胞。

3、選擇性培養(yǎng)

選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞,一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中,未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤--磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤--磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,但其本身不能在體外存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤--磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性,因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞,只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞,因此,必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法,篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞,并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后,及時進行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。
()體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。-2周后,腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖,并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約-2周,可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可獲得大量單克隆抗體。
(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中,雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體,收集培養(yǎng)上清液,離心去除細胞及其碎片,即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術和裝置不斷出現(xiàn),大大提高了抗體的量。

抗原準備

編輯
抗原,是指能夠刺激機體產(chǎn)生(特異性)免疫應答,并能與免疫應答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細胞在體外結合,發(fā)生免疫效應(特異性反應)的物質(zhì)??乖幕咎匦杂袃煞N,一是誘導免疫應答的能力,也就是免疫原性,二是與免疫應答的產(chǎn)物發(fā)生反應,也就是抗原性。
很多物質(zhì)都可以成為抗原,抗原的具體分類可以參見抗原,在進行單克隆抗體制備過程中,很多物質(zhì)都可以成為抗原,在常規(guī)的科研實驗中,科研者經(jīng)常選用每只小鼠/大鼠每次注射0~50ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。

動物免疫

編輯
單克隆抗體制備的宿主動物一般選用BALB/c小鼠,鼠單抗的應用范圍相當廣泛,一些國內(nèi)外公司均開發(fā)出了兔的單克隆抗體制備技術。
免疫原分為可溶性抗原和顆粒性(細胞)抗原,用無菌鹽水稀釋并與佐劑混合,腹腔注射抗原與佐劑*混勻后形成的穩(wěn)定乳狀液,在免疫原提供持續(xù)的免疫應答基礎上進行加強免疫
周期第天 采血0.2ml(獲得0.ml免疫前血清)
*次免疫(抗原加弗氏*佐劑)
第4天 第二次免疫(抗原加弗氏不*佐劑)
第2天 采血和ELISA檢測
第35天 第三次免疫(抗原加弗氏不*佐劑)
第42天 采血和ELISA檢測
第56天 第四次免疫(抗原溶于PBS或鹽水)
第6天 細胞融合

細胞融合

編輯

(一)融合劑

細胞融合的方法有物理法,如電融合、激光融合,化學融合法和生物融合法,如滅活的仙臺病毒,此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG),在分子量為200~700時,呈無色、無臭的粘稠狀液體,分子量大于000時,呈乳白色蠟狀固體,能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑,對熱穩(wěn)定,與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者,常用濃度為50%,pH8.0~pH8.2(用0%NaHCO3調(diào)整),分子量小的PEG,融合效應差,又有毒性,分子量過大,則粘性太大,不易操作。50%濃度,pH偏堿時融合效應zui高。也有采用30%~50%濃度的PEG加上0%二甲亞砜。不同批號的PEG,即使分子量相同,但融合率卻有明顯差異,選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應用。要買高純度的,一般選供氣相色譜用的PEG。

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