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提高PCR的忠實性

2018年07月02日 07:22:33人氣:619來源:上海士鋒生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞提高PCR的忠實性
【資料簡介】

帶有校正功能的酶 

包括克隆和效率分析,PCR產(chǎn)物表達(dá)或定點(diǎn)突變在內(nèi)的PCR應(yīng)用都需要高忠實性的PCR。Taq dna聚合酶被看做是低忠實性的聚合酶,因為其缺少3’到5’外切核酸酶(校正)活性。

使用帶有3’到5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶可以提高忠實性。 

但是這些聚合酶的產(chǎn)量比taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明顯比Taq DNA聚合酶忠實性高,而且?guī)в蠵latinum產(chǎn)品產(chǎn)量和特異性高的優(yōu)點(diǎn)(圖25)。 

使用人thrombospondin的1.1kb片段的探針對基因組DNA(泳道1到6分別為100,50,10,5,1和0ng)擴(kuò)增35個循環(huán)。A組,使用1單位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶,在室溫配制反應(yīng)液。B組,使用2.5單PfuTurbo™ DNA聚合酶,在冰上配制反應(yīng)液。C組,使用1單位Taq DNA聚合酶,在冰上配制反應(yīng)液。 

酶混合物 

將Taq DNA聚合酶同帶有3’到5’外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實性,并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長模板。Gibco BRL高保真酶混合物,Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠實性是單獨(dú)Taq DNA聚合酶的6倍,并可以zui高擴(kuò)增到12kb。 

其他參數(shù) 
除了酶,高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加度。如果四種核苷的濃度不同,忠實性會受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性,因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。

上海士鋒生物科技有限公司作者

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