α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶試劑盒說明書

【資料簡介】

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af） 試劑盒說明書 
                                                            分光光度法  50管/24樣 
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定 
測定意義：                            
α-L-Af  是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類，使細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖、
阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進(jìn)果膠的增溶和降解。由于果實(shí)成熟過程中常常伴隨
著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實(shí)成熟軟化中的研究具有重大意義。 
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af） 試劑盒說明書 測定原理： 
α-L-Af分解對硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm有zui大吸收峰，通過
測定吸光值升高速率來計(jì)算 α-L-Af活性。 
自備用品： 
可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。 
試劑組成和配制： 
提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。 
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試
劑仍-20℃保存。 
試劑二：液體15mL×1 瓶，4℃保存。 
試劑三：液體50mL×1 瓶，4℃保存。 
粗酶液提取： 
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104
個）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議 500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL提
取液） ，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲 3s，間隔10s，重復(fù)30 次）；
15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 
2、組織：按照組織質(zhì)量（g） ：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織，
加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af） 試劑盒說明書 測定步驟： 
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。 
2、樣本測定（在 EP管中依次加入下列試劑）： 
試劑名稱（μL）  測定管  對照管 
試劑一  200   
蒸餾水    200 
試劑二  250  250 
樣本    50  50 
迅速混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴30min 
試劑三  1000  1000 
充分混勻，400nm處測定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。  
α-L-Af活性計(jì)算： 
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y =0.00585x  -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL） ，y為吸光
值。 
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 
單位的定義：每 mg組織蛋白每 min產(chǎn)生 1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。 
α-L-Af活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T 
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr 
（2）按樣本鮮重計(jì)算： 
單位的定義：每 g組織每小時產(chǎn)生 1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。 
α-L-Af活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T 
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W 
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 
單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。 
α-L-Af活性(nmol/min/104
cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T   
=0.08×(ΔA +0.0027) 
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V樣：加入反應(yīng)體系中
樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；  500：細(xì)胞或細(xì)
菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。