DNA 連接

【資料簡介】

DNA分子的體外連接就是在一定條件下， 由DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段組鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過程， DNA分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)上進(jìn)行的。
帶有相同末端（平端或粘端）的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應(yīng)時(shí),外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA 的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到*水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。