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乙醇脫氫酶(ADH)活性測定試劑盒

2019年11月19日 15:00:40人氣:351來源:南京億迅生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞乙醇脫氫酶(ADH)活性測定試劑盒
【資料簡介】

測定意義:

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換,在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成,肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理:

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH340nm處有吸收峰,而NAD+沒有;測定340nm 吸光度下降速率,來計算ADH活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,室溫保存。

試劑二:液體×1瓶,4保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中,4保存。                 

試劑三:粉劑×1瓶,-20保存。

試劑四:液體×1支,4保存。

粗酶液提。

1、稱取約0.1g樣品,加試劑一1ml,冰上充分研磨,16000g 4離心20min,取上清待測。2、血清可以直接用于測定。

ADH測定操作:

1. 分光光度計預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25水浴中保溫30 min以上。

3. 空白管:在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測定吸光值變化,分別記錄15s75s時吸光值,分別記為A1A2。A空白管=A1-A2?瞻坠苤恍枳1~2個。

4. 測定管:在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測定吸光值變化,分別記錄15s75s時吸光值,分別記為A3A4。A測定管=A3-A4。

ADH活性計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A測定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V)÷T

=1.61×(△A測定管△A空白管) ÷Cpr

2按樣本鮮重計算

活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 1U

ADH (U/g 鮮重) =[(△A測定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V÷V樣總×W)÷T

=1.61×(△A測定管△A空白管) ÷W

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 LCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W 樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按蛋白濃度計算

活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 1U

ADH (U/mg prot) =[(△A測定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V)÷T

=3.22×(△A測定管△A空白管) ÷Cpr

2按樣本鮮重計算

活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 1U

ADH (U/g 鮮重) =[(△A測定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V÷V樣總×W)÷T

=3.22×(△A測定管△A空白管) ÷W

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d96孔板光徑,0.5 cmV反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW 樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1min。

注意事項:

上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

南京億迅生物科技有限公司作者

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