霍亂弧菌快檢試紙檢驗(yàn)法

【資料簡(jiǎn)介】

霍亂弧菌快檢試紙檢驗(yàn)法

1、什么是膠體金（金標(biāo)）檢驗(yàn)法？ 
　　膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，有其*的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。免疫膠體金技術(shù)的基本原理是：氯金酸 （HAuCl4）在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。免疫金標(biāo)記技術(shù)（Immunogold labelling techique） 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紫色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中。 
2、為什么霍亂可以用膠體金（金標(biāo)）檢驗(yàn)法進(jìn)行快速篩查 ？
　　霍亂弧菌快速檢測(cè)卡是利用單克隆抗體膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)研制而成，用于定性檢測(cè)樣本中可能存在的霍亂弧菌的特異性抗原 A及O139血清型 。 首先按常規(guī)方法制備并篩選出效價(jià)高的抗O1群A抗原和抗O139抗原的單抗細(xì)胞株。然后采用枸緣酸鈉還原法制備膠體金顆粒，選擇玻璃纖維吸附zui適濃度的金標(biāo)抗體。按常規(guī)方法免疫家兔，制備霍亂弧菌的多克隆抗體。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象（疑似病人糞便）的特殊性，研制了特異的萃取液，一方面可裂解細(xì)菌，釋放抗原，提高檢測(cè)敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。 
　　經(jīng)二年多的反復(fù)試制，完成的霍亂弧菌 O1群（O139）快速檢測(cè)試紙，其對(duì)霍亂弧兩zui低敏感性10分鐘內(nèi)10 6 菌/ml陽(yáng)性，達(dá)到臨床zui低檢出量的要求，符合衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》要求，且對(duì)高濃度的菌液10 9 菌/ml無(wú)前置反應(yīng)；用萃取液、正常人糞便標(biāo)本及其它大腸中寄生菌進(jìn)行的特異性鑒定表明，該試紙條特異性為100% 。

3、金特敏 ? 霍亂快速檢測(cè)卡的特點(diǎn)是什么？
zui低檢出量 ：不低于 10 5 cfu/ml適合臨床需要。
快速出結(jié)果 ： 萃取直接裂解細(xì)菌， 10分鐘觀(guān)察結(jié)果滿(mǎn)足疾病控制要求。 
便利使用 ：獨(dú)立包裝，“插”式設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)捷，避免二次污染。 
穩(wěn)定性好 ：無(wú)須冷藏，常溫保存 18個(gè)月。 
4、質(zhì)控線(xiàn)C線(xiàn)的意義是什么？ 
　　 將羊抗鼠抗體包被于 NC膜，形成對(duì)照線(xiàn)C，同時(shí)在NC膜的一端固定膠體金標(biāo)記的霍亂弧菌A抗原單隆抗體。檢測(cè)時(shí)，樣品依靠層析作用，沿著NC膜向前爬行。不論樣品中是否含霍亂弧菌，也就是說(shuō)無(wú)論金標(biāo)抗體是否結(jié)合霍亂弧菌抗原，都有一部分能與羊抗鼠抗體結(jié)合，形成紫色線(xiàn)的對(duì)照線(xiàn)C，即出現(xiàn)出現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)C線(xiàn)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)是有效的。 

5、為什么T線(xiàn)可作為檢測(cè)線(xiàn)？ 
　　 采用雙抗體夾心法，在 NC膜包被羊抗鼠抗體同時(shí)，在另一側(cè)包被霍亂弧菌O1（O139）多抗，形成T檢測(cè)線(xiàn)。疑似霍亂病人的糞便樣品中若含有一定數(shù)量的霍亂弧菌，則與檢測(cè)端的金標(biāo)抗體結(jié)合，向前爬行經(jīng)過(guò)檢測(cè)線(xiàn)時(shí)，金標(biāo)抗體－抗原復(fù)合物再與多抗結(jié)合，在局部沉積，出現(xiàn)紫色線(xiàn)，形成T檢測(cè)線(xiàn)，反之則不出現(xiàn)紫色T檢測(cè)線(xiàn)。 

6、為什么C、T兩條線(xiàn)都顯色才可判為陽(yáng)性？
　　 因?yàn)椴捎秒p抗體夾心法，同時(shí)在 NC膜上包被了羊抗鼠抗體和霍亂弧菌O1多抗，被檢樣品中若含霍亂弧菌，在與標(biāo)記在檢測(cè)卡檢測(cè)端的膠體金霍亂抗原結(jié)合后，沿NC膜爬行，與在T線(xiàn)形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—霍亂弧菌A（O139）抗原—霍亂弧菌O1多抗混合物，與C線(xiàn)形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—羊抗鼠抗體混合物，即出現(xiàn)兩條線(xiàn)才為陽(yáng)性。 

7、只有C線(xiàn)，無(wú)T線(xiàn)說(shuō)明了什么？ 
　　 此結(jié)果判定為陰性，在檢測(cè)線(xiàn) T線(xiàn)處，無(wú)膠體金免疫復(fù)合物形成，故不顯色；在質(zhì)控C線(xiàn)處形成膠體金—霍亂弧菌單克隆抗體—羊抗鼠抗體混合物，說(shuō)明膠體金標(biāo)記正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。 

8、C、T兩線(xiàn)都不顯色怎么辦？
　 若經(jīng)重復(fù)檢驗(yàn)后， C、T兩線(xiàn)仍不顯色，說(shuō)明膠體金標(biāo)記失敗，檢測(cè)卡因受潮等原因失效。 

9、為什么會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性？
　　目前按衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》要求，霍亂弧菌培養(yǎng)陽(yáng)性才可認(rèn)定為確診病例，假陽(yáng)性是針對(duì)霍亂弧菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果（金標(biāo)準(zhǔn)）而言，根據(jù)臨床驗(yàn)證應(yīng)用以來(lái)的結(jié)果顯示，我們認(rèn)為可能與以下三種情況有關(guān)： 

•  根據(jù)本檢測(cè)卡的檢測(cè)原理，是檢測(cè)疑似病人糞便中的霍亂弧菌 O1 A抗原或O139抗原，與是否含有活菌無(wú)關(guān)，只要感染過(guò)霍亂弧菌，且達(dá)到一定的抗原量即可顯示檢測(cè)陽(yáng)性，病人即使服藥后亦可檢出陽(yáng)性。 

•  在某省的臨床驗(yàn)證中，曾出現(xiàn) 10 4 /ml即可檢出的情況，高于衛(wèi)生部《霍亂防治手冊(cè)》中10 6 -10 8 /ml的檢出線(xiàn)。曾有一檢測(cè)卡陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)4次堿胨水增菌后，才培養(yǎng)出活菌。 

•  在經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，本檢測(cè)卡與副溶血弧菌、溶藻弧菌、麥?zhǔn)匣【?、河弧菌、?chuàng)傷弧菌、鼠傷*、氣單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等 14種常見(jiàn)腸道細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，除此外是否還有其他的交叉反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)菌，我們正在探討。 

10、假陰性會(huì)出現(xiàn)嗎？
　　 任何診斷試劑都有一定的漏診率和誤診率，由于霍亂的特殊性，我們盡量提高檢出率，提高靈敏度、特異度，減少漏診（假陰性）。三個(gè)省級(jí)疾控中心 1680例臨床檢測(cè)的靈敏度是98.61%，特異度是100%。出現(xiàn)假陰性可能與樣品中的細(xì)菌含量低、或檢測(cè)卡失效等因素（受潮、膠體金標(biāo)記失敗等）有關(guān)。 

11、為什么一定要用萃取液？
　　 為使檢測(cè)端的金標(biāo)單抗與霍亂弧菌 O1菌體抗原A（O139）更充分地結(jié)合，要使霍亂弧菌抗原充分暴露，有必要使用萃取液裂解細(xì)菌，這一方面可提高檢測(cè)敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。我們查閱了有關(guān)文獻(xiàn)，并多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，選擇了特異性的萃取液裂解細(xì)菌，所以在檢測(cè)時(shí)，一定要將標(biāo)本與萃取液充分混合，裂解細(xì)菌，只有這樣才能提高檢出率，達(dá)到盡早篩查疑似病人，控制疫情的目的。