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細(xì)胞實驗技術(shù)匯總-細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)

2012年11月09日 15:37:52人氣:1638來源:上海信裕生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞細(xì)胞,細(xì)胞價格
【資料簡介】

細(xì)胞實驗技術(shù)匯總-細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)
【實驗?zāi)康摹?/span>

了解核酸、蛋白質(zhì)、糖及酶的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理,掌握 Brachet 反應(yīng)及堿性蛋白、酸

性蛋白、糖原和過氧化物酶的細(xì)胞化學(xué)染色方法。

【實驗用品】

一、材料和標(biāo)本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的 Hela 細(xì)胞。

二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、

水浴箱。

三、試劑 PBS 緩沖液(pH7.2)、甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液、純丙酮、l/2 丙酮+1/2 

甲苯、純二甲苯、70%乙醇、5%三氯醋酸、0.1%堿性固綠、0.1%酸性固綠、0.5%硫酸

銅、聯(lián) 苯胺混合液、%番紅、無 水乙醇、過 碘酸酒精液、S chiff 氏酒精液、亞 硫酸水、E hrlieh

蘇木精、95%乙醇、Carnoy 固定液甲醇:冰醋酸=3:1,體積比

【實驗內(nèi)容】

細(xì)胞的組織化學(xué)方法,是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)

的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物,再通過顯微鏡對組織內(nèi)的生

物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。

一、Brachet 反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的 DNA 和 RNA

原理

細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后,其中的 DNA 和 RNA 出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng),一般

認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力,且這兩種染料的

作用有選擇性,甲基綠染高聚分子的 DNA 呈藍(lán)綠色,呱咯寧染低聚分子的 RNA 呈紅色。由

此對細(xì)胞中的 DNA 和 RNA 進(jìn)行定位、定性、和定量分析。

方法

l.接種 Hela 細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng) 2448 小時,使長成單層。

2.取出蓋片,用 PBS(pH7.2)輕輕沖洗蓋片表面去除殘渣。

3.放入 Carnoy 固定液中固定 小時。

4.浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中 30 分鐘染色。

5.取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗 2(2秒鐘左右,吸去水分。放入純丙酮

中分色 2秒鐘。

6. 放入 l丙酮+1二甲苯中 秒鐘。

7.放入純二甲苯中透明 分鐘。

8.滴一滴中性樹膠于載玻片上,將蓋片標(biāo)本面朝下封片。

9.鏡下觀察

(三)結(jié)果

細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色,細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色,而其中核仁被染成紫紅色(參照照片)。

二、細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示

(一)原理

由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同,在 pH 值不同的溶液中,蛋

白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理條件下,整個蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多,則為酸性

蛋白質(zhì);帶正電荷多,則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此,可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后,用

不同 pH 值的固綠染液分別染色,細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。

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(二)方法

1.以破壞脊髓法處死蟾蜍,將其腹面向上放人蠟盤中,剪開胸腔,打開心包。小心將

心臟剪一小口,取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端,推片,按此法制備二張血涂片,室溫

晾干。

2. 將涂片作好標(biāo)記放在 70%乙醇中固定 分鐘,室溫晾干。

3.放入 5%三氯醋酸中 60℃30 分鐘,抽提出核酸。

4.清水沖洗多次(分鐘以上),以沖去痕跡的三氯醋酸。

5.濾紙吸干玻片上水分。

6. 一張片放入 0.1%堿性固綠(pH8.08.5)中染色 1015 分鐘,另一張片放入 0.1

酸性固綠(pH2.02.5)染色 510 分鐘。

7.清水沖洗,蓋上蓋片鏡檢。

(三)結(jié)果

經(jīng)堿性固綠染色片中,胞質(zhì)、核仁不著色,細(xì)胞核大部分被染成綠色,是為堿性蛋白

質(zhì)存在處(參照照片)。經(jīng)酸性固綠染色片中,因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白,被染成綠色。

三、細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的顯示

(一)原理

過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物,用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本,細(xì)胞內(nèi)的過氧化物

酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán),進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物,因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定

過氧化物酶的有無或多少。

(二)方法

1.取小鼠一只,以頸椎脫位法將其處死,迅速剖開其后肢暴露出股骨,將股骨一端斜

向剪斷,用 PBS 緩沖液濕潤過的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。

2.推片,室溫晾干。

3.將涂片放入 0.5%硫酸銅中浸 30 ~1 分鐘。

4.取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng) 分鐘。

5.清水沖洗,放入 1%番紅溶液中復(fù)染 分鐘。

6.清水沖洗,室溫晾干。

7.鏡檢或封片后鏡檢。

(三)結(jié)果

涂片中可見一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒,為過氧化物酶所在位置。

四、過碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)——顯示細(xì)胞內(nèi)糖原參照照片和示教片

原理

組織、細(xì)胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法來顯示,其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過碘

酸的氧化作用,打開碳鏈形成醛,生成的醛基與 Schiff 試劑中的無色品紅反應(yīng)形成紫紅色

化合物。

方法

l.取 l~2mm 厚的肝組織塊,用 Carnoy 氏液 4℃固定 4小時。

2.乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋,切片。

3.用 70%乙醇展片。

4.脫蠟:二甲苯(1)5 分鐘二甲苯(2)5 分鐘→100%乙醇 分鐘含 1%火棉膠的乙

醇液 分鐘→70%乙醇 分鐘。

5.直接浸入過碘酸酒精液反應(yīng) 515 分鐘,經(jīng) 70%乙醇洗片刻。

6.浸入 Schiff 氏酒精液反應(yīng) 15 分鐘。

7.亞硫酸水洗三次,以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素,以及擴(kuò)散的染料。

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8.流水沖洗 3分鐘。

9.蒸餾水洗。

10.浸入 Ehrlich 蘇木精復(fù)染 20~30 秒,使細(xì)胞核著色。

11.脫水:95%乙醇 分鐘二次→100%乙醇 分鐘二次二甲苯透明 10 分鐘二次。

12.加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。

結(jié)果

細(xì)胞中呈紫紅的顆粒即為糖原參照照片。

五、蘇丹染色——顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪示教片


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