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*蛋白激酶受體B6抗體,Anti-EphB6R

2012年12月23日 15:43:04人氣:273來(lái)源:上海安研商貿(mào)有限公司

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【資料簡(jiǎn)介】

*蛋白激酶受體B6抗體,Anti-EphB6R

一、鹽析法
取x ml血清加x ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀離心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理鹽水溶解沉淀,再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此時(shí),(NH4)2SO4的飽和度為33%]重復(fù)上述第二步過(guò)程1~2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
↓對(duì)PBS充分透析、換液3次,至萘氏試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色,即無(wú)NH4+為止。
取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后,以751型紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。
影響鹽析的因素很多,如蛋白質(zhì)的濃度,鹽的濃度,飽和度和pH,溫度等都可影響鹽析的結(jié)果,操作時(shí)要充分注意(參閱本章 第二節(jié) )。
二、冷酒精沉淀法
分離過(guò)程如下。血清加3倍體積的蒸餾水,調(diào)節(jié) pH至7.7(±)冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下,加預(yù)冷的酒精(-20℃)到zui終濃度為20%,保持在-5℃。產(chǎn)生的沉淀(A),含有大多數(shù)種類(lèi)的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸調(diào)節(jié) pH到5.1,產(chǎn)生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液內(nèi)。調(diào)節(jié) 上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到zui終濃度為25%,維持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。不同動(dòng)物,IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見(jiàn)表2-5。從沉淀(B)可按下述方法進(jìn)一步分離出IgA和IgM的混合物:將沉淀(B)懸浮在0℃ 水中,調(diào)節(jié) pH到5.1,離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié) 上清液離子強(qiáng)度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui終濃度為10%,保持在–2℃或-3℃低溫,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 從幾種動(dòng)物和人血清沉淀A分離IgM的條件
物 種   pH   沉淀?xiàng)l件   IgG產(chǎn)量
    酒精濃度(%)   離子強(qiáng)度   
人   5.1   15.   0.01   65
山羊   5.2   0   0.01   65
家兔   5.2   10   0.01   70
大鼠   5.0   15   0.01   50
豚鼠   5.1   15   0.01   70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50)為弱堿性陽(yáng)離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點(diǎn)為pH6.85~7.5),其余均屬酸性蛋白。PH7.2~7.4的環(huán)境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過(guò)柱層析,γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG.

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