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士鋒生物關(guān)于如何轉(zhuǎn)基因小鼠報(bào)告的詳細(xì)介紹

2013年04月21日 23:21:19人氣:1881來(lái)源:上海士鋒生物科技有限公司

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【資料簡(jiǎn)介】

 在研發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠或基因嵌入報(bào)告基因模式小鼠的過(guò)程中,經(jīng)常要用到報(bào)告基因。常用的報(bào)告基因包括:lacZ、EGFP、zsGreenEYFP、DsRed (DsRed2)、mRFP、mCherry、HuCD2Thy1.1、HA tag、FLAG tag、Luciferase等。那什么時(shí)候選擇哪種reporter?

做小鼠胚胎發(fā)育的研究人員一般喜歡用LacZ,也就是將LacZ置于一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。用LacZ可以進(jìn)行胚胎全身染色(whole body staining),這樣可以了解一個(gè)基因在體內(nèi)的表達(dá)譜全貌。如果做細(xì)胞跟蹤,比如免疫細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞等,一般喜歡用熒光蛋白。這樣一是容易對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離比如FACS)和體外分析,二是容易對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)追蹤比如Adoptive transfer)。早些年用的zui多的是EGFPEYFP。有的時(shí)候,我們需要將兩種不同的reporter小鼠交配在一起,研究?jī)蓚€(gè)基因的關(guān)系,這時(shí)可以將兩個(gè)基因采用不同的熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記,也就是做兩種不同的模式小鼠。因?yàn)樵缙诖蠹叶嗍怯?/span>EGFP,現(xiàn)在可以多做一些其它熒光蛋白的報(bào)告基因小鼠,以便跟以前研發(fā)的EGFP小鼠結(jié)合起來(lái)研究。 zsGreenEGFP, EYFP都是綠色熒光。EGFPEYFP很難區(qū)分開(kāi)。zsGreen是一個(gè)比較穩(wěn)定的綠色熒光蛋白。DsRedTdTomato都是紅色熒光。這兩種熒光蛋白都有報(bào)告基因模式小鼠發(fā)表。TdTomato是一個(gè)信號(hào)非常強(qiáng)的熒光蛋白,目前已經(jīng)有報(bào)告基因小鼠發(fā)表,對(duì)細(xì)胞/小鼠也沒(méi)有明顯的毒性。相信以后會(huì)有越來(lái)越多的小鼠用TdTomato來(lái)做報(bào)告基因。雖然mRFPmCherry是兩個(gè)非常好的熒光蛋白,但由于它們需要584nm的激發(fā)光,所以一般的FACS儀器不能檢測(cè)到信號(hào),需要用到LSRII這樣的儀器,而很多實(shí)驗(yàn)室可能沒(méi)有這樣的儀器。也有用EBFP, ECFP做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的,但用到小鼠上的比較少。比如需要用到紫外光來(lái)激發(fā)。如果想在一個(gè)小鼠里表達(dá)兩種熒光蛋白,是用兩種分得比較開(kāi)的,比如,不要同時(shí)用EGFPEYFP

HuCD2Thy1.1是細(xì)胞表面受體。HuCD2因?yàn)槿サ袅?/span>C-term序列,使得其失去了信號(hào)傳導(dǎo)的功能。那什么時(shí)候會(huì)用這兩種分子?比如我們想研究一個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白基因比如轉(zhuǎn)錄因子的功能,經(jīng)常需要把表達(dá)這個(gè)蛋白的細(xì)胞分離純化出來(lái)。這個(gè)時(shí)候可以將HuCD2Thy1.1報(bào)告基因放置在這個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白基因啟動(dòng)子下比如加一個(gè)IRES-Thy1.1), 這樣所有表達(dá)這個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的細(xì)胞都會(huì)在細(xì)胞表面表達(dá)Thy1.1。這樣就可以用anti-Thy1.1抗體將這一群細(xì)胞分離出來(lái),進(jìn)行后續(xù)研究。當(dāng)然也可以用anti-Thy1.1抗體進(jìn)行組織切片的免疫熒光檢測(cè)。

HA、FLAGBiotin等是細(xì)胞和生化實(shí)驗(yàn)中常用的標(biāo)簽多肽或蛋白。在Western blot,免疫沉淀(Immunoprecipitation)等實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到,因?yàn)橛蟹浅L禺惖?/span>HAFlag抗體。Biotin可以跟(Streptavidin)直接結(jié)合并用于免疫沉淀。在模式小鼠中,這些標(biāo)簽多肽或蛋白可以與要研究的蛋白做成融合蛋白。這種模式小鼠zui常被用到的是Chip-chip實(shí)驗(yàn)。比如要研究一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能,就需要知道這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)正?;虼碳l件下結(jié)合到染色體基因組DNA的位置以及結(jié)合序列。我們知道,特異性好、親和力高的抗轉(zhuǎn)錄因子的抗體非常不容易得到或制備。這個(gè)時(shí)候可以將標(biāo)簽多肽比如FLAG)放在轉(zhuǎn)錄因子的C-term,做成融合蛋白。刺激細(xì)胞之后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)交聯(lián),并破碎細(xì)胞以及基因組DNA,然后用anti-FLAG抗體作免疫沉淀,將轉(zhuǎn)錄因子沉淀下來(lái)。zui后分析這些轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合的DNA段序列,從而找到該轉(zhuǎn)錄因子的在基因組上的識(shí)別序列,也就找到了該轉(zhuǎn)錄因子的作用基因。

熒光素酶做報(bào)告基因模式小鼠,一般是為了做活體成像實(shí)驗(yàn)。比如在一個(gè)細(xì)胞因子啟動(dòng)子下面放置熒光素酶基因。免疫小鼠之后,有些細(xì)胞或器官表達(dá)該細(xì)胞因子同時(shí)表達(dá)熒光素酶。通過(guò)注射熒光素酶底物可以檢測(cè)熒光在小鼠體內(nèi)的分布,從而得出該細(xì)胞因子在不同免疫條件下的表達(dá)情況。熒光素酶在癌癥研究中也經(jīng)常用。通過(guò)熒光活體成像可以研究腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

 

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