士鋒生物關(guān)于如何轉(zhuǎn)基因小鼠報(bào)告的詳細(xì)介紹

【資料簡(jiǎn)介】

 在研發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠或基因嵌入報(bào)告基因模式小鼠的過(guò)程中，經(jīng)常要用到報(bào)告基因。常用的報(bào)告基因包括：lacZ、EGFP、zsGreen、EYFP、DsRed （DsRed2）、mRFP、mCherry、HuCD2、Thy1.1、HA tag、FLAG tag、Luciferase等。那什么時(shí)候選擇哪種reporter呢?

做小鼠胚胎發(fā)育的研究人員一般喜歡用LacZ，也就是將LacZ置于一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。用LacZ可以進(jìn)行胚胎全身染色（whole body staining），這樣可以了解一個(gè)基因在體內(nèi)的表達(dá)譜全貌。如果做細(xì)胞跟蹤，比如免疫細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等，一般喜歡用熒光蛋白。這樣一是容易對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離（比如FACS）和體外分析，二是容易對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)追蹤（比如Adoptive transfer）。早些年用的zui多的是EGFP和EYFP。有的時(shí)候，我們需要將兩種不同的reporter小鼠交配在一起，研究?jī)蓚€(gè)基因的關(guān)系，這時(shí)可以將兩個(gè)基因采用不同的熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記，也就是做兩種不同的模式小鼠。因?yàn)樵缙诖蠹叶嗍怯?/span>EGFP，現(xiàn)在可以多做一些其它熒光蛋白的報(bào)告基因小鼠，以便跟以前研發(fā)的EGFP小鼠結(jié)合起來(lái)研究。 zsGreen和EGFP, EYFP都是綠色熒光。EGFP和EYFP很難區(qū)分開(kāi)。zsGreen是一個(gè)比較穩(wěn)定的綠色熒光蛋白。DsRed和TdTomato都是紅色熒光。這兩種熒光蛋白都有報(bào)告基因模式小鼠發(fā)表。TdTomato是一個(gè)信號(hào)非常強(qiáng)的熒光蛋白，目前已經(jīng)有報(bào)告基因小鼠發(fā)表，對(duì)細(xì)胞/小鼠也沒(méi)有明顯的毒性。相信以后會(huì)有越來(lái)越多的小鼠用TdTomato來(lái)做報(bào)告基因。雖然mRFP和mCherry是兩個(gè)非常好的熒光蛋白，但由于它們需要584nm的激發(fā)光，所以一般的FACS儀器不能檢測(cè)到信號(hào)，需要用到LSRII這樣的儀器，而很多實(shí)驗(yàn)室可能沒(méi)有這樣的儀器。也有用EBFP, ECFP做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的，但用到小鼠上的比較少。比如需要用到紫外光來(lái)激發(fā)。如果想在一個(gè)小鼠里表達(dá)兩種熒光蛋白，是用兩種分得比較開(kāi)的，比如，不要同時(shí)用EGFP和EYFP。

HuCD2和Thy1.1是細(xì)胞表面受體。HuCD2因?yàn)槿サ袅?/span>C-term序列，使得其失去了信號(hào)傳導(dǎo)的功能。那什么時(shí)候會(huì)用這兩種分子呢?比如我們想研究一個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白基因（比如轉(zhuǎn)錄因子）的功能，經(jīng)常需要把表達(dá)這個(gè)蛋白的細(xì)胞分離純化出來(lái)。這個(gè)時(shí)候可以將HuCD2或Thy1.1報(bào)告基因放置在這個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白基因啟動(dòng)子下（比如加一個(gè)IRES-Thy1.1）, 這樣所有表達(dá)這個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的細(xì)胞都會(huì)在細(xì)胞表面表達(dá)Thy1.1。這樣就可以用anti-Thy1.1抗體將這一群細(xì)胞分離出來(lái)，進(jìn)行后續(xù)研究。當(dāng)然也可以用anti-Thy1.1抗體進(jìn)行組織切片的免疫熒光檢測(cè)。

HA、FLAG、Biotin等是細(xì)胞和生化實(shí)驗(yàn)中常用的標(biāo)簽多肽或蛋白。在Western blot，免疫沉淀（Immunoprecipitation）等實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到，因?yàn)橛蟹浅Ｌ禺惖?/span>HA、Flag抗體。Biotin可以跟（Streptavidin）直接結(jié)合并用于免疫沉淀。在模式小鼠中，這些標(biāo)簽多肽或蛋白可以與要研究的蛋白做成融合蛋白。這種模式小鼠zui常被用到的是Chip-chip實(shí)驗(yàn)。比如要研究一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能，就需要知道這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)（正?；虼碳l件下）結(jié)合到染色體基因組DNA的位置以及結(jié)合序列。我們知道，特異性好、親和力高的抗轉(zhuǎn)錄因子的抗體非常不容易得到或制備。這個(gè)時(shí)候可以將標(biāo)簽多肽（比如FLAG）放在轉(zhuǎn)錄因子的C-term，做成融合蛋白。刺激細(xì)胞之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，并破碎細(xì)胞以及基因組DNA，然后用anti-FLAG抗體作免疫沉淀，將轉(zhuǎn)錄因子沉淀下來(lái)。zui后分析這些轉(zhuǎn)錄因子所結(jié)合的DNA段序列，從而找到該轉(zhuǎn)錄因子的在基因組上的識(shí)別序列，也就找到了該轉(zhuǎn)錄因子的作用基因。

熒光素酶做報(bào)告基因模式小鼠，一般是為了做活體成像實(shí)驗(yàn)。比如在一個(gè)細(xì)胞因子啟動(dòng)子下面放置熒光素酶基因。免疫小鼠之后，有些細(xì)胞或器官表達(dá)該細(xì)胞因子同時(shí)表達(dá)熒光素酶。通過(guò)注射熒光素酶底物可以檢測(cè)熒光在小鼠體內(nèi)的分布，從而得出該細(xì)胞因子在不同免疫條件下的表達(dá)情況。熒光素酶在癌癥研究中也經(jīng)常用。通過(guò)熒光活體成像可以研究腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。