線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒分光光度法

【資料簡(jiǎn)介】

線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒分光光度法 25 管/24 樣 
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 
測(cè)定意義 
復(fù)合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱 NADH-CoQ 還原酶或 NADH 脫氫酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、
微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中zui大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對(duì)電子從
NADH 傳遞給CoQ，同時(shí)可使O2還原生成 O2.-
，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生O2.-
的主要部位。
測(cè)定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）
生成狀態(tài)。 
線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒分光光度法 測(cè)定原理 
復(fù)合體Ⅰ能夠催化NADH 脫氫生成 NAD+
， 在 340nm下測(cè)定 NADH 的氧化速率計(jì)算出該酶
活性的大小。 
需自備的儀器和用品 
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。 
試劑的組成和配制 
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑二：5mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑四：25mL×1 瓶，-20℃保存； 
試劑五：1 mL×1 支，-20℃保存； 
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，用時(shí)加入2mL蒸餾水，現(xiàn)配現(xiàn)用； 
工作液的配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用； 
樣本的前處理： 
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離： 
①  準(zhǔn)確稱取 0.1g組織或收集 500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL試劑一和 10uL 試劑三，用冰
浴勻漿器或研缽勻漿。 
②  將勻漿 600g，4℃離心5min。 
③  棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。 
④  上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅰ（此步可選
做） 。 
⑤  步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超聲 3s，間隔 10秒，重復(fù)30 次），用于復(fù)合體Ⅰ酶活性測(cè)定。 
測(cè)定步驟： 
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 
2、 樣本測(cè)定 
（1）工作液于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。 
（2）在 1mL石英比色皿中加入 40μL樣本、800μL工作液和 60μL試劑六，立即混勻，
記錄 340nm處初始吸光值 A1和  2min后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。 
  
復(fù)合體Ⅰ活力單位的計(jì)算 
線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒分光光度法 （1）按蛋白濃度計(jì)算 
單位的定義：每 mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
  復(fù)合體Ⅰ活力 （nmol/min/mg prot） =[ΔA×V反總÷ （ε×d） ×109
]÷(V樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr 
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。 
（2）  按樣本鮮重計(jì)算 
單位的定義：每 g組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
  復(fù)合體Ⅰ活力（nmol/min/g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(W×  V 樣÷V 樣總) 
÷T=365×ΔA÷W 
（3）  按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 
復(fù)合體Ⅰ活力(nmol/min/104
 cell)=[ΔA×V反總÷ （ε×d） ×109
]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA 
V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10-4
 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103
 L  / mol  /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。 
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