試劑和器材：

1. OptiPrepTM（600g*，ρ=1.32g/ml）；

2. OptiPrepTM稀釋劑（OptiPrepTM diluent，OD）：150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L*基*-KOH，pH7.8；

3. 勻漿介質(zhì)（HM）：0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L*基*-KOH，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀釋劑和勻漿介質(zhì)中加入蛋白酶抑制劑；

4. 高轉(zhuǎn)矩橋式電動(dòng)機(jī)（半導(dǎo)體開關(guān)控制）；

5. Potter-Elvehjem勻漿器，20—40ml，孔隙約0.07mm；

6. 高速離心機(jī)，帶可容納15—50ml離心管的吊桶式轉(zhuǎn)子；

7. 注射器，帶金屬*（內(nèi)徑約0.8mm）；

8. 尼龍濾網(wǎng)。

實(shí)驗(yàn)方法：

所有操作在0—4℃下進(jìn)行。

1. 制備500g/L*工作液：每5倍體積OptiPrepTM用1倍體積的OptiPrepTM稀釋劑來稀釋；

2. 梯度溶液：用勻漿介質(zhì)（分別為6倍體積+4倍體積和7倍體積+3倍體積）來稀釋500g/L*工作液以制備300g/L和350g/L的兩種*梯度溶液。保持于冰上。

3. 切除肝臟并用剪刀剪切成微小碎塊；

4. 將大約一半肝臟轉(zhuǎn)移到Potter-Elvehjem勻漿器的20ml勻漿介質(zhì)中，并用研杵研磨約8次，在約500r/min轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)以破碎組織；

5. 對另一半肝臟切碎物重復(fù)以上操作；

6. 用尼龍濾網(wǎng)過濾；

7. 通過與等體積的500g/L*工作液混合將勻漿液調(diào)整到250g/L*；

8. 將10—15ml勻漿液轉(zhuǎn)移到50ml管中，從300g/L和350g/L的*梯度溶液中各取10ml加到勻漿液之下；

9. 在100000g下離心20min；

10. 細(xì)胞核在300g/L和350g/L*界面上成帶，用注射器和金屬*吸取細(xì)胞核；

11. 用2倍體積的勻漿介質(zhì)稀釋懸液，在2000g下離心10min沉淀細(xì)胞核。

原文地址:/biotech/exp/molbio/Molecular/2011/x816372438.html